2021-09-05 11:32:30

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细胞生物学
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酶切是对粘末端的DNA分子和载体分子进行切割,以获得相应的粘末端连接。酶切可以是单酶切也可以是双酶切。单酶切操作比较简单,双酶切困难。

基本信息

  • 中文名称

    酶切

  • 属性

    生物学术语

目录

折叠 编辑本段 定义

酶切可以是单酶切也可以是双酶切。单酶切操作比较简单,但双酶切如果两种酶所用缓冲液成分不同(主要是盐离子浓度不同)或反应温度不同,这时可以采用如下措施解决:1)先用一种酶切,然后乙醇沉淀回收DNA分子后再用另外一种酶切;2)先进行低盐要求的酶酶切,然后添加盐离子浓度到高盐的酶反应要求,加入第二种酶进行酶切;3)使用通用缓冲液进行双酶切。具体要根据酶的反应要求进行,尽量避免活力损失。

折叠 编辑本段 步骤

一、实验材料准备

1. 材料:质粒DNA。

2. 试剂:限制性内切酶、ddH2O。

3 . 仪器:微量移液枪,离心机,水浴锅, 电泳仪,紫外透射观测仪。

二、单酶切

1. 在1.5 mL灭菌离心管中依次加入:

(1)质粒DNA:X μL(约1 μg)。

(2)限制性内切酶:1 μL(约10 U)。

(3)10×buffer:2 μL。

(4)ddH2O:补足20 μL。

2. 混匀,做好标记。

3. 37℃水浴1-3 h。

4. 70℃水浴10 min中止反应。

5. 电泳检测酶切效果。

三、双酶切

1. 在1.5 mL灭菌离心管中依次加入:

(1)质粒DNA:X μL(约1 μg)。

(2)限制性内切酶1:1 μL(约10 U)。

(3)限制性内切酶2:1 μL(约10 U)

(3)10×buffer:1或2 μL。

(4)ddH2O:补足20 μL。

2. 混匀,做好标记。

3. 37℃水浴1-3 h。

4. 70℃水浴10 min中止反应。

5. 电泳检测酶切效果。

四、结果与分析

假若一种酶在环状质粒DNA中只有一个酶切位点, 且酶切彻底,紫外灯下检测电泳结果,则单酶切应为一条带, 而双酶切则为两条带。如果条带数目多于理论值,那么有可能是酶切不完全。如果酶切结果与酶切前的质粒条带一样(超螺旋、线性和开环三条带),则说明质粒完全没有被切开。

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