2021-11-11 10:45:59

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分子生物学
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DNA测序(DNA sequencing,或译DNA定序)是指分析特定DNA片段的碱基序列,也就是腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)与鸟嘌呤的(G)排列方式。快速的DNA测序方法的出现极大地推动了生物学和医学的研究和发现。

在基础生物学研究中,和在众多的应用领域,如诊断,生物技术,法医生物学,生物系统学中,DNA序列知识已成为不可缺少的知识。具有现代的DNA测序技术的快速测序速度已经有助于达到测序完整的DNA序列,或多种类型的基因组测序和生命物种,包括人类基因组和其他许多动物,植物和微生物物种的完整DNA序列。

基本信息

  • 中文名称

    DNA测序

  • 外文名称

    DNA sequencing

  • 释义

    指分析特定DNA片段的碱基序列

  • 性质

    测定未知序列

折叠 编辑本段 测序目的

确定重组DNA的方向与结构,对突变进行定位、鉴定和比较研究

折叠 编辑本段 发展历史

70年代末,WalterGilbert发明化学法、FrederickSanger发明双脱氧终止法手动测序,同位素标记

80年代中期,出现自动测序仪(应用双脱氧终止法原理)、荧光代替同位素,计算机图象识别

90年代中期,测序仪重大改进、集束化的毛细管电泳代替凝胶电泳

2001年完成人类基因组框架图

折叠 编辑本段 国内状况

人类基因组计划、基因芯片、个性化分子诊断、生物云计算……这些在21世纪第一个十年里吸引无数眼球的热门词汇,都和一个产业颇有渊源--DNA测序。生物技术和信息技术在这片创意新天地里水乳交融,如果用一句诗来形容坐拥两大技术护航的DNA测序产业,那就是--天生丽质难自弃。

在业内人士眼里,DNA测序出身高贵,它破解基因密码(即碱基序列),将基因组学与IT技术相结合,发展出一门新兴学科--生物信息学。以它为代表的基因技术,颠覆了传统生物学技术,引领生命科学未来发展潮流。以它为代表的基因工程,在医疗健康、环境保护、新能源、新材料、现代农业等热门领域大显身手。

在业外人士眼里,DNA测序足够高科技,堪称"一项新技术衍生出一个新行业"的典范,在短时间内迅速成为国内外VC和PE的宠儿,发展速度之快以至于没有人能准确描绘出它十年后的发展蓝图。在日新月异的DNA测序技术面前,任何预测可能都显得保守。

高科技领域就是这样一个诞生传奇的地方。DNA测序已从一项令人高山仰止的前沿技术迅速普及为生命科学常规技术。DNA测序成本下降的速度几乎可与电脑芯片运算能力增强的速度匹敌。DNA测序的发展不仅体现在成本的降低,更表现在高通量测序使得工作效率得到了大幅提高,这就为DNA测序产业化铺平了道路。

在DNA测序商业化的浪潮下,我国《生物产业发展"十二五"规划》提出完成10000种微生物、100种动植物基因组测序、发现约500个新的功能基因、转化应用5个以上有重大经济价值的基因或蛋白。按照每种微生物进行"基因组完成图"测序的费用为30-50万元来看,DNA测序带来的市场容量达千亿元,这还仅仅是DNA测序商业应用市场的冰山一角。

折叠 编辑本段 测序原理

化学修饰法测序原理

化学试剂处理末段DNA片段,造成碱基的特异性切割,产生一组具有各种不同长度的DNA链的反应混合物,经凝胶电泳分离。化学切割反应:包括碱基的修饰,修饰的碱基从其糖环上转移出去在失去碱基的糖环处DNA断裂。

Sanger法测序的原理

就是利用一种DNA聚合酶来延伸结合在待定序列模板上的引物。直到掺入一种链终止核苷酸为止。每一次序列测定由一套四个单独的反应构成,每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP),并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基团,使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A、T或C处终止。终止点由反应中相应的双脱氧而定。每一种dNTPs和ddNTPs的相对浓度可以调整,使反应得到一组长几百至几千碱基的链终止产物。它们具有共同的起始点,但终止在不同的的核苷酸上,可通过高分辨率变性凝胶电泳分离大小不同的片段,凝胶处理后可用X-光胶片放射自显影或非同位素标记进行检测。

折叠 编辑本段 测序规律

生成互相独立的若干组带放射性标记的寡核苷酸,每组寡核苷酸都有固定的起点,但却随机终止于特定的一种或者多种残基上。

由于DNA上的每一个碱基出现在可变终止端的机会均等,因此上述每一组产物都是一些寡核苷酸混合物,这些寡核苷酸的长度由某一种特定碱基在原DNA全片段上的位置所决定。

在可以区分长度仅差一个核苷酸的不同DNA分子的条件下,对各组寡核苷酸进行电泳分析,只要把几组寡核苷酸加样于测序凝胶中若干个相邻的泳道上,即可从凝胶的放射自影片上直接读出DNA上的核苷酸顺序。

折叠 编辑本段 测序技术

高通量测序技术(High-throughput sequencing)又称"下一代"测序技术("Next-generation" sequencing technology),以能一次并行对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定和一般读长较短等为标志。

根据发展历史、影响力、测序原理和技术不同等,主要有以下几种:大规模并行签名测序(Massively Parallel Signature Sequencing, MPSS)、聚合酶克隆(Polony Sequencing)、454焦磷酸测序(454 pyrosequencing)、Illumina (Solexa) sequencing、ABI SOLiD sequencing、离子半导体测序(Ion semiconductor sequencing)、DNA 纳米球测序 (DNA nanoball sequencing)等。

MPSS

由Lynx Therapeutics公司在90年代发展的Massively Parallel Signature Sequencing, MPSS技术是"下一代"测序技术发展的先驱。MPSS 是一种基于磁珠(bead)和接头(adaptor)连接和解码的复杂技术,测定结果短,多用于转录组测序,测定基因表达量。MPSS测定结果有序列偏好性而易丢失DNA中某些特定序列,且操作复杂,已逐渐淡出,被新的方法替代。

Polony Sequencing

2005年哈佛George Church实验室发展起来的,基于乳化PCR(emulsion PCR)和自动显微镜等技术的测序方法。相关技术已整合进ABI公司的SOLiD测序技术平台。

454 焦磷酸测序

由454公司发展的并行焦磷酸测序方法。该方法在油溶液包裹的水滴中扩增DNA(即emulsion PCR),每一个水滴中开始时仅包含一个包被大量引物的磁珠和一个链接到微珠上的DNA模板分子(控制DNA浓度出现的大概率事件)。将emlusion PCR产物加载到特制的PTP板上,板上有上百万个孔,每个微孔只能容纳一个磁珠。DNA Polymerase在将一个dNTP聚合到模板上的时候,释放出一个PPi(焦磷酸分子);在ATP-Sulfurylase(ATP硫酸化酶)催化下,PPi与APS生成一个ATP分子;ATP分子在Luciferase(荧光素酶)的作用下,将luciferin(荧光素)氧化成oxy luciferin,同时产生的可见光被CCD光学系统捕获,获得一个特异的检测信号,信号强度与相应的碱基数目成正比。通过按顺序分别并循环添加四种dNTP,读取信号强度和发生时间,实现DNA序列测定。这一技术的读长和每一碱基耗费都介于Sanger法测序和Solexa和SOLiD方法之间。454公司现下属于Roche公司。

Illumina (Solexa) sequencing

Solexa公司开发了一种可反转的染料终止法。DNA模板首先连接到与固体介质(如玻璃板)交联的引物上,并扩增形成本地微克隆。四种ddNTPs依次添加到体系中,未结合的ddNTPs在添加下一种核苷酸前被冲洗走。与454的焦磷酸测序不同,这种方法一次只延伸一个碱基。

折叠 编辑本段 测序方法

自动测序法

基因分析仪(即DNA测序仪),采用毛细管电泳技术取代传统的聚丙烯酰胺平板电泳,应用该公司专利的四色荧光染料标记的ddNTP(标记终止物法),因此通过单引物PCR测序反应,生成的PCR产物则是相差1个碱基的3'末端为4种不同荧光染料的单链DNA混合物,使得四种荧光染料的测序PCR产物可在一根毛细管内电泳,从而避免了泳道间迁移率差异的影响,大大提高了测序的精确度。由于分子大小不同,在毛细管电泳中的迁移率也不同,当其通过毛细管读数窗口段时,激光检测器窗口中的CCD(charge-coupled device)摄影机检测器就可对荧光分子逐个进行检测,激发的荧光经光栅分光,以区分代表不同碱基信息的不同颜色的荧光,并在CCD摄影机上同步成像,分析软件可自动将不同荧光转变为DNA序列,从而达到DNA测序的目的。分析结果能以凝胶电泳图谱、荧光吸收峰图或碱基排列顺序等多种形式输出。

它是一台能自动灌胶、自动进样、自动数据收集分析等全自动电脑控制的测定DNA片段的碱基顺序或大小和定量的高档精密仪器。PE公司还提供凝胶高分子聚合物,包括DNA测序胶(POP 6)和GeneScan胶(POP 4)。这些凝胶颗粒孔径均一,避免了配胶条件不一致对测序精度的影响。它主要由毛细管电泳装置、Macintosh电脑、彩色打印机和电泳等附件组成。电脑中则包括资料收集,分析和仪器运行等软件。它使用最新的CCD摄影机检测器,使DNA测序缩短至2.5h,PCR片段大小分析和定量分析为10~40min。

由于该仪器具有DNA测序,PCR片段大小分析和定量分析等功能,因此可进行DNA测序、杂合子分析、单链构象多态性分析(SSCP)、微卫星序列分析、长片段PCR、RT-PCR(定量PCR)等分析,临床上可除进行常规DNA测序外,还可进行单核苷酸多态性(SNP)分析、基因突变检测、HLA配型、法医学上的亲子和个体鉴定、微生物与病毒的分型与鉴定等。

一、准备工作

1. BigDye测序反应试剂盒 主要试剂是BigDye Mix,内含PE专利四色荧光标记的ddNTP和普通dNTP,AmpliTaq DNA polymerase FS,反应缓冲液等。

2. pGEM-3Zf (+) 双链DNA对照模板 0.2 g/L,试剂盒配套试剂。

3. M13(-21)引物 TGTAAAACGACGGCCAGT,3.2 μmol/L,即3.2 pmol/μl,试剂盒配套试剂。

4. DNA测序模板 可以是PCR产物、单链DNA和质粒DNA等。模板浓度应调整在PCR反应时取量1 μl为宜。本实验测定的质粒DNA,浓度为0.2 g/L,即200 ng/μl。

5. 引物需根据所要测定的DNA片段设计正向或反向引物,配制成3.2 μmol/L,即3.2 pmol/μl。如重组质粒中含通用引物序列也可用通用引物,如M13(-21)引物,T7引物等。

6. 灭菌去离子水或三蒸水。

7. 0.2 ml或和0.5 ml的PCR管 盖体分离。

8. 3 mol/L 醋酸钠(pH5.2) 称取40.8 g NaAc·3H2O溶于70 ml蒸馏水中,冰醋酸调pH至5.2,定容至100 ml,高压灭菌后分装。

9. 70%乙醇和无水乙醇

10. NaAc/乙醇混合液 取37.5 ml无水乙醇和2.5 ml 3 mol/L NaAc混匀,室温可保存1年。

11. POP 6测序胶 。

12. 模板抑制试剂(TSR) 。

13. 10×电泳缓冲液

14. 全自动DNA测序仪

15. PCR仪。

16. 台式冷冻高速离心机

17. 台式高速离心机或袖珍离心机。

二、PCR测序反应

1. 取0.2 ml的PCR管,用记号笔编号,将管插在颗粒冰中,按下表加试剂:

所加试剂 测定模板管 标准对照管

BigDye Mix 1 μl 1 μl

待测的质粒DNA 1 μl -

pGEM-3Zf (+) 双链DNA - 1 μl

待测DNA的正向引物 1 μl -

M13(-21)引物 - 1 μl

灭菌去离子水 2 μl 2 μl

总反应体积5 μl,不加轻矿物油或石蜡油,盖紧PCR管,用手指弹管混匀,稍离心。

2. 将PCR管置于9600或2400型PCR仪上进行扩增。98℃变性2 min后进行PCR循环,PCR循环参数为96℃ 10 s,50℃ 5 s,60℃4 min,25个循环,扩增结束后设置4℃保温。

三、醋酸钠/乙醇法纯化PCR产物

1. 将混合物离心,将扩增产物转移到1.5 ml EP管中。

2. 加入25 μl醋酸钠/乙醇混合液,充分振荡,置冰上10 min以沉淀DNA。12 000 r/min于4℃离心30 min,小心弃上清。

3. 加70%(V/V)的乙醇50 μl洗涤沉淀2次。12 000 r/min于4℃离心5 min,小心弃上清和管壁的液珠,真空干燥沉淀10~15 min。

四、电泳前测序PCR产物的处理

1. 加入12 μl的TSR于离心管中,剧烈振荡,让其充分溶解DNA沉淀,稍离心。

2. 将溶液转移至盖体分离的0.2 ml PCR管中,稍离心。

3. 在PCR仪上进行热变性(95℃ 2 min),冰中骤冷,待上机。

五、上机操作

1. 按仪器操作说明书安装毛细管,进行毛细管位置的校正,人工手动灌胶和建立运行的测序顺序文件。

2. 仪器将自动灌胶至毛细管,1.2 kV预电泳5 min,按编程次序自动进样,再预电泳(1.2 kV,20 min),在7.5 kV下电泳2 h。

3. 电泳结束后仪器会自动清洗,灌胶,进下一样品,预电泳和电泳。

4. 每一个样品电泳总时间为2.5 h。

5. 电泳结束后仪器会自动分析或打印出彩色测序图谱。

六、序列分析

仪器将自动进行序列分析,并可根据用户要求进行序列比较。如测序序列已知,可通过序列比较以星号标出差异碱基处,提高工作效率。

七、仪器清洗

测序完毕按仪器操作规程进行仪器清洗与保养。

八、计算

1. 测序反应精确度计算公式:100%-差异碱基数(不包括N数)/650×100%。

2. 差异碱基即测定的DNA序列与已知标准DNA序列比较不同的碱基,N为仪器不能辨读的碱基。

非同位素银染色法

SILVER SEQUENCETM DNA测序系统是一种无放射性的序列分析系统,它通过灵敏的银染方法检测凝胶中的条带。 银染提供了一种对于放射性或荧光法来说更加快速,廉价的替代方法。测序结果可以在同一天内得到;电泳完成后经90分钟就可读序,这是常规的放射性测序法做不到的。 此外,SILVER SEQUENCETM系统用未修饰的5'OH寡聚核苷酸作为引物,减少了特殊修饰寡聚核苷酸的花费。该系统不需要放射性方法中对同位素的谨慎操作,也不需要荧光法或化学发光技术的昂贵试剂。另外,也不需要象大多数荧光法那样用仪器来检测序列条带。

Taq DNA聚合酶在95℃时极强的热稳定性。本系统利用的测序级Taq DNA聚合酶是一种Taq DNA聚合酶的修饰产品,对于双链DNA模板有非常好的效果,具有高度的准确性,能产生均一的条带,且背景低。

SILVER SEQUENCETM系统包含被修饰的核苷酸混合物,如7-去氮dGTP(7-deaza dGTP,或dITP)替代dGTP可清除由GC丰富区域所引起的条带压缩现象。

退火温度是热循环测序中最重要的因素。高退火温度可减少模板二级结构。提高引物结合模板配对的严谨性。链重退火和模板二级结构则限制了小片断PCR产物(<500bp)得到清楚的序列数据的能力。引物延伸起始于每个循环的退火阶段。在较低温度时,聚合酶可能会遇到坚固的二级结构区域,它可导致聚合酶解离。则在四个电泳道中均有同一相对位置的条带。因为这些原因,应该使用尽可能高的退火温度。对于有牢固二级结构的模板建议使用95℃变性、70℃退火/延伸的循环模式。一般来说,较长的引物及GC含量高的引物能得到较强的信号。实验结果表明,>24mer的GC含量约为50%的引物可得到最佳结果。

由于本系统采用热循环装置, 与常规的测序方法相比具有如下几点好处:(1).本方法线性扩增模板DNA产生足够的产物使银染技术能够检测序列条带,测序反应需要0.03~2pmol模板DNA,随模板种类而定。(2). 在每一个变性循环中的高温可以取代对双链DNA(dsDNA)模板的碱变性及乙醇沉淀过程,变性循环也有助于消除由于线性dsDNA模板(如PCR反应产物)快速重退火所引起的问题。(3). 高温聚合酶反应减弱了DNA模板的二级结构,允许聚合酶穿过高度二级结构化的区域。

一、试剂准备

1. SILVER SEQUENCETM DNA测序试剂盒。

2. 丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺储备液(38%丙烯酰胺 W/V,2%甲叉双丙烯酰胺 W/V):95 g丙烯酰胺,5 g甲叉双丙烯酰胺溶于140 ml 双蒸水中,定容至250 ml,0.45 mm过滤器过滤后,贮于棕色瓶中,置于4℃冰箱可保存2周。

3. 10%过硫酸铵,0.5 g过硫酸铵溶于4 ml水中,定容至5 ml,应新配新用。

4. 10×TBE缓冲液(1 mol/L Tris, 0.83mol/L 硼酸,10 mmol/L EDTA): 121.1 g Tris,51.35 g硼酸,3.72 g Na2EDTA ·2H2O,溶于双蒸水中定容至1升,置于4℃下可贮存2周,其pH约为8.3。

5. TBE电极缓冲液:10×TBE 缓冲液稀释至1×TBE备用。

6. TEMED

7. 固定/停止溶液:10%冰醋酸(V/V)配制2升备用。

8. 染色溶液:硝酸银2 g,甲醛3 ml,溶于2升超纯水中备用。

9. 显影溶液:60 g碳酸钠(Na2CO3)溶于2升超纯水中,使用前加3 ml 37%甲醛和40 ml硫代硫酸钠溶液(10 mg/ml)。

10. 95%乙醇。

11. 0.5%冰乙酸。

12. Sigmacote (Sigma CAT. #SL-2)。

二、测序反应

1. 对于每组测序反应,标记四个0.5 ml eppendorf管(G、A、T、C)。每管加入2 ml适当的d/ddNTP混合物(d/ddNTP Mix)。各加入1滴(约20 μl)矿物油,盖上盖子保存于冰上或4℃备用。

2. 对于每组四个测序反应,在一个eppendorf管中混合以下试剂:

(1) 样品反应:

质粒模板DNA :2.1 pmol

5×测序缓冲液 : 5 ml

引物: 4.5 pmol

无菌ddH2O 至终体积16 ml

(2)对照反应

pGEM-3Zf(+)对照DNA(4 mg) :4.0 ml

5×测序缓冲液: 5 ml

pUC/M13正向引物(4.5 pmol) :3.6 ml

3. 在引物/模板混合物(以上第2步)中加入1.0 ml测序级Taq DNA聚合酶(5 μ/ml)。用吸液器吸动几次混匀。

4. 从第3步的酶/引物/模板混合物中吸取4 ml加入每一个d/ddNTP混合物的管内。

5. 在微量离心机中离心一下,使所有的溶液位于eppendorf管底部。

6. 把反应管放入预热至95℃的热循环仪,以【注意】中循环模式为基准,开始循环程序。对于每个引物/模板组合都必须选择最佳退火温度。下列程序一般能读出从引物开始350碱基的长度。

7. 热循环程序完成后,在每个小管内加入3 μlDNA测序终止溶液,在微量离心机中略一旋转,终止反应。

【注意】

(1)测序所用模板DNA的量一般按下面要求加入:

模板种类/长度 模板量

200 bp(PCR产物):16 ng(120 fmol)

3000~5 000 bp(超螺旋质粒DNA): 4 mg(2 pmol)

48 000 bp(λ,粘粒DNA): 1 mg(31 fmol)

由于超螺旋质粒产生的信号比松弛的线性双链DNA弱,因此使用超螺旋质粒作为模板时其用量要比其它模板大一些。

(2)计算与4.5 pmol相当的引物纳克数可用以下一般公式:

4.5 pmol=1.5 ng×n,其中n为引物碱基数

计算与1p mol相当的引物微克数可用以下一般公式:

dsDNA:1 pmol=(6.6×10mg)×n,其中n为模板碱基对数

ssDNA:1pmol=(3.3×10mg)×n,其中n为模板碱基数

(3)为阻止Taq DNA聚合酶延伸非特异性退火引物, 热循环仪必须预热至95℃。温度变换应越快越好。下面的循环时间不包括变温时间。如果你无法确定使用何种模式,建议从模式1开始。

模式1:适用于引物<24碱基或GC含量<50%

95℃ 2分钟,然后: 95℃ 30秒(变性),42℃ 30秒(退火),70℃ 1分钟(延伸)。

模式2:适用于≥24碱基或略短的GC含量≥50%的引物。

95℃ 2分钟,然后:95℃ 30秒(变性),70℃ 30秒(退火/延伸)。

(4)在加入终止溶液之后样品可在4℃保存过夜。

三、测序凝胶板的制备

1. 玻璃板的处理

银染测序的玻璃板一定要非常清洁,一般先用温水和去污剂洗涤,再用去离子水冲洗玻璃板,除去残留的去污剂,最后用乙醇清洗玻璃板。玻璃板上遗留的去污剂微膜可能导致凝胶染色时背景偏高(棕色)。短玻璃板经粘合溶液处理可将凝胶化学交联于玻璃板上。这一步对于在银染操作过程中防止凝胶撕裂至关重要。

(1)短玻璃板的处理

① 在1 ml95%乙醇,0.5%冰乙酸中加入5 ml粘合硅烷(Bind Silane),配成新鲜的粘合溶液。

② 用经浸透新配的粘合溶液浸透的吸水棉纸擦拭仔细清洗过并已经自然干燥的玻璃板,整个板面都必须擦拭。

③ 4~5分钟后,用95%乙醇单向擦玻璃板,然后略用力沿垂直方向擦拭。重复三次这一清洗过程,每次均须换用干净的纸,除去多余的粘合溶液。

【注意】

① 在95%乙醇单向擦玻璃板时过度用力会带走过多的粘合硅烷,使凝胶不能很好地粘附。

② 准备长玻璃板之前要更换手套,防止粘染粘合硅烷。

③ 防止粘合溶液沾染在长玻璃板上是很重要的,否则将导致凝胶撕裂。

(2)长玻璃板的处理:

① 用浸透Sigmacote溶液的棉纸擦拭清洗过的长玻璃板。

② 5~10分钟后用吸水棉纸擦拭玻璃板以除去多余的Sigmacote溶液。

【注意】

① 用过的凝胶可在水中浸泡后用剃须刀片或塑料刮刀刮去。玻璃板须用去污剂完全清洗。或者凝胶用10%NaOH浸泡后除去。为防止交叉污染,用于清洗短玻璃板的工具必须与清洗长玻璃板的工具分开,如果出现交叉污染,以后制备的凝胶可能撕裂或变得松弛。

2. 凝胶的制备

(1)玻璃板经粘合硅胶和Sigmacote处理后,即可固定玻璃板。该方法是用0.2 mm或0.4 mm厚的边条置于玻璃板左右两侧,将另一块玻璃板压于其上。在长玻璃板的一侧插入鲨鱼齿梳平的一面边缘,用夹子固定住。

(2)根据所需要的凝胶浓度,按下表制备测序凝胶,一般6%~8%的胶浓度可获得较好的结果。配制过程中,先用适量双蒸水溶解尿素,再加入Acr&Bis和10×TBE缓冲液,再用双蒸水调终体积至99.2 ml,并用0.45 mm的滤膜过滤,然后加过硫酸铵和TEMED。溶解尿素时不必加热。如果确需加热则应等溶液完全冷却后,方可加入TEMED和过硫酸铵。一般在胶灌制后4~6分钟,即开始聚合,如果聚合不好,则应使用高浓度的TEMED和过硫酸铵。

(3)胶配制好后,即可灌制胶板。一般是将凝胶沿着压条边缘缓慢地倒入玻璃板的槽中,倒完后,静止放置使之聚合完全。

【注意】

① 使用夹子固定玻璃板时,最好夹子的力量稍大一些,防止因力量不足使灌胶的过程中出现漏胶液现象。

② 灌制凝胶的过程中要严防产生气泡,否则影响测序的结果。

四、电泳

1. 预电泳

(1)当凝胶聚合完全后,拨出鲨鱼齿梳,将该梳子反过来,把有齿的一头插入凝胶中,形成加样孔。

(2)立即将胶板固定在测序凝胶槽中,一般测序凝胶槽的上下槽是分开的,因而只有在固定好凝胶板后,方能加入TBE缓冲液。

(3)稀释10×TBE缓冲液至1×TBE,将该缓冲液加入上下二个电泳槽中,去除产生的气泡,接上电源准备预电泳。

(4)有些电泳槽,如LKB的Macrophor等是使用水浴加热的,则应先将水浴加热至55℃后进行预电泳。有的不使用水浴加热,依靠电泳过程中自身产生的热进行保温,如上海求精有机玻璃仪器生产的测序电泳槽,这种槽需夹上二块散热铝板,使整个凝胶板的温度一致。

(5)按30 V/cm的电压预电泳20~30分钟。预电泳的过程是去除凝胶的杂质离子,同时使凝胶板达到所需的温度。高温电泳可防止GC丰富区形成的发夹状结构,影响测序的结果。

【注意】

① 用鲨鱼齿梳制作加样孔时,应注意将齿尖插入胶中0.5mm左右,千万注意不能使加样孔渗漏,否则得不到正确的结果。

② 应时刻注意上面电泳槽中的缓冲液是否渗漏,否则极易造成短路而损坏电泳仪。

2. 样品的制备

当在预电泳时,即可进行样品的制备,将反应完毕的样品在沸水浴中加热1~3分钟,立即置于冰上即可。如果样品长时间不用,则应重新处理。可使用4~6%聚丙烯酰胺凝胶,胶厚0.4 mm。厚度小于0.4 mm的胶可能导致信号太弱。加样时不必吸去上层覆盖的矿物油,但要小心地吸取矿物油下的蓝色样品。

3. 上样及电泳

关闭电泳仪,用移液枪吸缓冲液清洗样品孔,去除在预电泳时扩散出来的尿素,然后立即用毛细管进样器吸取样品,加入样品孔中。上样顺序一般为G、A、T、C。加样完毕后,立即电泳。开始可用30 V/cm进行电泳,5分钟后可提高至40~60 V/cm,并保持恒压状态。一般来说,一个55 cm长,0.2 mm厚的凝胶板,在2500 V恒压状态下电泳2小时即可走到底部,同时在电泳过程中,电流可稳定地从28 mA降至25 mA。为了能读到更长的序列,可采用两轮或多轮上样。

【注意】

① 上样电泳时,一定要注意凝胶板的温度是否达到55℃左右,如果还没有达到,则应等温度达到后才能上样电泳。

② 一般来说电泳时,不宜使用太高的电压,因为太高的电压会使凝胶的分辨率降低,并且使带扩散。电泳中可进行恒功率电泳。

五、测序凝胶的银染

染色过程要求凝胶浸在塑料盘中。因而至少使用两个盘子,大小与玻璃板类似。在盘中加入新鲜溶液之前须用高质量的水洗涤盘子。

1. 电泳完毕后用一个塑料片子小心地分开两板,凝胶应该牢固地附着在短玻璃板上。

2. 固定凝胶:将凝胶(连玻璃板)放入塑料盘,用固定/停止溶液浸没,充分振荡20分钟或直至样品中染料完全消失,胶可在固定/停止溶液中保存过夜(不振荡)。保留固定/停止溶液,用于终止显影反应。

3. 洗胶:用超纯水振荡洗胶3次,每次2分钟。从水中取出,当转移至下一溶液时拿着胶板边沿静止10~20秒,使水流尽。

4. 凝胶染色:把凝胶移至染色溶液充分摇动30分钟。

5. 凝胶显影

(1)在显影溶液中加入甲醛(3 ml)和硫代硫酸钠溶液(400 μl)以完成显影液的配制。

(2)从染色溶液中取出凝胶放入装有超纯水的盘中浸洗5~10秒。注意,把凝胶从超纯水转移到显影溶液的总时间不能长于5~10秒。浸泡时间过长则导致信号微弱或丧失信号。若浸泡时间过长,可重复第五步用染色液浸泡。

(3)立刻将凝胶转移至1升(总量的一半)预冷的显影液充分振荡直至模板带开始显现或开始出现第一批条带,把凝胶移入剩下的1升显影液中继续显影2~3分钟或直至所有条带出现。

6. 固定凝胶:在显影液中直接加入等体积的固定/停止溶液。停止显影反应,固定凝胶。

7. 在超纯水中浸洗凝胶两次,每次2分钟,注意在本操作中戴手套拿着胶板边缘避免在胶上印上指纹。

8. 将凝胶置于室温干燥或用抽气加热法干燥。在可见光灯箱或亮白,黄色背景(如纸)上观察凝胶,若需永久保存的记录, 则可用EDF胶片保留实验结果。

【注意】

测序产物的银染是显现序列信息的一种新方法,本系统的成败受几个因素的影响

① 水的质量对于染色的成功极其重要。超纯水(NANOpureR或Milli-QR的水)或双蒸水可获得较好的效果,如果水中有杂质,则低分子量条带可能无法出现。

② 碳酸钠也非常重要。使用新鲜的,美国化学学会级碳酸钠较好,如Fisher和Kodak ACS试剂级碳酸钠(Fisher Cat #S263-500或S262-3,或Kodak Cat #109-1990),一般可获得较好的结果。

③ 色后的洗涤步骤是非常关键的。如果凝胶洗涤时间太长,银颗粒会脱离DNA,产生很少或没有序列信号。如果洗涤时间过长,染色步骤可以重新进行。

④ 如果凝胶厚度超过0.4 mm或丙烯酰胺浓度高于4~6%,则有必要延长固定和染色的时间。如果凝胶比0.4 mm薄,染色反应后的洗涤必须缩短至不超过5秒。

⑤ 在室温下进行所有步骤,显影反应除外。显影溶液必须预冷至10~12℃以减小背景杂色。注意:临用前在显影溶液中加入甲醛和硫代硫酸钠。用新配的染色及显影溶液。不要重复使用任何溶液。

六、EDF胶片显影

使用EDF胶片可增强测序条带的对比度,如果测序胶上条带很淡,我们建议把数据转移至EDF胶片,银染胶在其影像转移至EDF胶片之后可增强条带可读性。

1. 在暗室内,将染色过的粘于玻璃板的凝胶(胶面向上)置于荧光灯箱上。如有合适的漫射板,亦可用白灯箱,为确保曝光时间,用一小条EDF胶片曝光不同时间,检查不同的曝光强度,一般曝光20~40秒可得较好结果。

2. 在红灯下找到EDF胶片有缺刻的一角,然后把胶片置于凝胶上,使缺口位于左上角。由于EDF胶片是单面的,因此必须确保缺口在左上角。

3. 在EDF胶片上放置一干净、干燥的玻璃板,开亮灯箱约20秒。

4. 用冲显放射自显影胶片的步骤手工显影EDF胶片,可使用下列操作过程:

(1) 在Kodak GBX显影液中显影1~5分钟;

(2) 水洗1分钟;

(3)在Kodak GBX定影液中定影3分钟;

(4)水洗1分钟。

【注意】

① 进行EDF胶片显影之前凝胶必须完全干燥。戴手套进行操作,以免印上指纹。同时注意EDF胶片不能用自动胶片处理器。

② 对于不同的光源最佳曝光时间可能不同,通过对一小条EDF胶片曝光不同时间以选择你所用光源的最佳曝光时间,参阅胶片说明书。

③ 曝光时间短则EDF胶片影像较深,曝光时间长则有助于减弱背景。

鸟枪法

"鸟枪法"是一种由生物基因组提取目的基因的方法。首先利用物理方法(如剪切力、超声波等)或酶化学方法(如限制性内切核酸酶)将生物细胞染色体DNA切割成为基因水平的许多片段,继而将这些片段与适当的载体结合,将重组DNA转入受体菌扩增,获得无性繁殖的基因文库,再结合筛选方法,从众多的转化子菌株中选出含有某一基因的菌株,从中将重组的DNA分离、回收。

这种方法也就是应用基因工程技术分离目的基因,其特点是绕过直接分离基因的难关,在基因组DNA文库中筛选出目的基因。可以说这是利用"溜散弹射击"原理去"命中"某个基因。由于目的基因在整个基因组中太少太小,在相当程度上还得靠"碰运气",所以人们称这个方法为"鸟枪法"或"散弹枪"实验法。

一、用限制酶切下目的片段的大片段InsertDNA,并用Agarose凝胶电泳进行回收。

二、对回收的大片段DNA用物理方法(如超声波等)进行切断处理,然后用T4DNAPolymerase对小片段DNA进行末端平滑化。

三、进行Agarose电泳,切胶回收1kbp~2kbp的小片段DNA。然后用BcaBestDNAPolymerase在DNA的3'端加上一个A碱基。

四、把加上A-tail的DNA片段连入T-Vector中,然后转化,挑选克隆。

五、对阳性克隆(含1kbp~2kbpInsert)进行DNA测序。

六、对数据进行编辑,最后连成一条大片段的DNA序列。

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