2022-07-20 19:17:14

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分子生物学
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考马斯亮蓝(coomassie brilliant blue)一定范围内与蛋白质浓度成正比,因此可用于蛋白质的定量测定。

基本信息

  • 中文名称

    考马斯亮蓝

  • 外文名称

    coomassie brilliant blue

  • 分类

    G-250和R-250

折叠 编辑本段 化学性质

分子结构如图《Coomassie brilliant blue G-250》。

考马斯亮蓝有G-250和R-250两种。

游离状态的考马斯亮蓝G250 在酸性溶液中呈蓝偏绿色,与蛋白质结合后呈蓝色,蛋白质含量与颜色的深浅成正比,经595nm 测定,可作出蛋白质含量与吸光度值的标准曲线,并求出未知样品的蛋白质浓度。R-250呈蓝色,有轻微红色。

折叠 编辑本段 染色

蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合在2min左右的时间内达到平衡,完成反应十分迅速;其结合物在室温下1h内保持稳定。该法是1976年Bradford建立,试剂配制简单,操作简便快捷,反应非常灵敏,灵敏度比Lowry法还高4倍,可测定微克级蛋白质含量,测定蛋白质浓度范围为0~1 000μg/mL,是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。

考马斯亮蓝有G-250和R-250两种。其中考马斯亮蓝G-250由于与蛋白质的结合反应十分迅速,常用来作为蛋白质含量的测定。考马斯亮蓝R-250与蛋白质反应虽然比较缓慢,但是可以被洗脱下去,所以可以用来对电泳条带染色。

折叠 编辑本段 测定含量

折叠 简介

该方法用于大多数蛋白质的定量是比较精确的,但不适用于小分子碱性多肽的定量。如核糖核酸酶或溶菌酶。去污剂的浓度超过0.2%影响测定结果,如TritonX-100、SDS、NP-40等。常用于细胞骨架的检验。

折叠 浓染液

将100mg考马斯亮蓝G-250溶于50mL 95%乙醇,加入100mL 85%的磷酸,然后,用蒸馏水补充至1000mL,此染液放4℃至少6个月保持稳定。

折叠 样本准备

尽量使用与待测样本性质相近的蛋白质作为标准品,例如测定抗体,可用纯化的抗体作为标准。如果待测样本是未知的,也可用抗体作为标准蛋白。通常在20μg-150μg/100μL之间绘制标准曲线。

折叠 溶解

将待测样本溶于100~1缓冲溶液中,该缓冲溶液应与制作标准曲线的缓冲溶液相同(最好用PBS)。

折叠 稀释

按1:5用蒸馏水稀释浓染料结合溶液,如出现沉淀,过滤除去。

折叠 作用

每个样本加5mL稀释的染料结合溶液,作用5~30min。染液与蛋白质结合后,将由红色变为蓝色,在595nm波长下测定其吸光度。注意,显色反应不得超过30min。

折叠 计算

根据标准曲线计算待测样本的浓度。

折叠 编辑本段 沾到皮肤后的处理方法

考马斯亮蓝和皮肤中蛋白质通过范德华力结合,反应快速,并且稳定,无法用普通试剂洗掉。待一两周左右,皮屑细胞自然衰老脱落即可无碍。

阅读全文

生物化学与分子生物学方法与技术

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