2020-12-20 11:49:43

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一种免疫学技术,将产生抗体的单个B淋巴细胞同骨髓肿瘤细胞进行细胞融合, 获得既能产生抗体, 又能无限增殖的杂种细胞,并以此生产抗体。是仅由一种类型的细胞制造出来的抗体,对应于多克隆抗体、多株抗体--由多种类型的细胞制造出来的一种抗体。

基本信息

  • 中文名称

    单克隆抗体技术

  • 外文名称

    monoclonal antibody technique

  • 类别

    一种免疫学技术

  • 发明

    Kohler

  • 设备

    杂交瘤技术来制备

  • 缩写

    mAb

  • 简称

    单抗

折叠 编辑本段 技术介绍

单克隆抗体技术单克隆抗体技术单克隆抗体技术(monoclonal antibody technique) 1975年英国科学家Milstein和Kohler所发明,并获得1984年诺贝尔医学奖。 1984 德国人G. J. F.Kohler、阿根廷人C. Milstein[3]和丹麦科学家N. K. Jerne由于发展了单克隆抗体技术,完善了极微量蛋白质的检测技术而分享了诺贝尔生理医学奖。 其原理是: B淋巴细胞能够产生抗体, 但在体外不能进行无限分裂; 而瘤细胞虽然可以在体外进行无限传代, 但不能产生抗体。将这两种细胞融合后得到的杂交瘤细胞具有两种亲本细胞的特性。免疫反应是人类对疾病具有抵抗力的重要因素。当动物体受抗原刺激后可产生抗体。抗体的特异性取决于抗原分子的决定簇,各种抗原分子具有很多抗原决定簇,因此,免疫动物所产生的抗体实为多种抗体的混合物。用这种传统方法制备抗体效率低、产量有限,且动物抗体注入人体可产生严重的过敏反应。此外,要把这些不同的抗体分开也极困难。近年,单克隆抗体技术的出现,是免疫学领域的重大突破。

折叠 编辑本段 基本原理

哺乳类细胞DNA合成可分为两条途径,①从头(de novo)合成途径,利用磷酸核糖焦磷酸和尿嘧啶,可被氨基蝶呤(A)阻断;②补救(salvag-e)合成途径,在次黄嘌呤磷酸核糖转化酶( HGPRT)存在下利用次黄嘌呤(H)和胸腺嘧啶(T)。

单克隆抗体技术的流程为:脾细胞和骨髓瘤细胞在聚乙二醇(PEG)作用下发生细胞融合;加人HAT选择培养基(含H、A和T)后,未融合的骨髓瘤细胞因其从头合成途径被氨基蝶呤阻断,而又缺乏HGPRT不能利用补救途径合成DNA,从而死亡;未融合的脾细胞难以在体外培养而死亡;融合细胞因从脾细胞获得HGPRT,故可在HAT选报培养基中存活和增殖。

折叠 编辑本段 操作过程

折叠 动物免疫

(1) 抗原制备。制备单克隆抗体的免疫抗原,从纯度上说虽不要求很高,但高纯度的抗原使得到所需单抗的机会增加,同时可以减轻筛选的工作量。因此,免疫抗原是越纯越好,应 根据所研究的抗原和实验室的条件来决定。一般来说,抗原的来源有限,或性质不稳定,提纯时易变性,或其免疫原性很强,或所需单抗是用于抗原不同组分的纯化 或分析等,免疫用的抗原只需初步提纯甚至不提纯,但抗原中混杂物很多,特别是如果这些混杂物的免疫原性较强时,则必须对抗原进行纯化。检测用抗原可以是与 免疫抗原纯度相同,也可是不同的纯度,这主要决定于所用筛检方法的种类及其特异性和敏感性。

(2) 免疫动物的选择。根据所用的骨髓瘤细胞可选用小鼠和大鼠作为免疫动物。因为,所有的供杂交瘤技术用的小鼠骨髓瘤细胞系均来源于BALB/c小鼠,所有的大鼠骨髓瘤细胞都来 源于LOU/c大鼠,所以一般的杂交瘤生产都是用这两种纯系动物作为免疫动物。但是,有时为了特殊目的而需进行种间杂交,则可免疫其他动物。种间杂交瘤一 般分泌抗体的能力不稳定,因为染色体容易丢失。就小鼠而言,初次免疫时以8-12周龄为宜,雌性鼠较便于操作。

(3) 免疫程序的确定。免疫是单抗制备过程中的重要环节之一,其目的在于使B淋巴细胞在特异抗原刺激下分化、增殖,以利于细胞融合形成杂交细胞,并增加获得分泌特异性抗体的杂交 瘤的机会。因此在设计免疫程序时,应考虑到抗原的性质和纯度、抗原量、免疫途径、免疫次数与间隔时间、佐剂的应用及动物对该抗原的应答能力等。没有一个免 疫程序能适用于各种抗原。现用的免疫程序中多数是参照制备常规多克隆抗体的方法。表6-1列举了目前常用的免疫程序。免疫途径常用体内免疫法包括皮下注 射、腹腔或静脉注射,也采用足垫、皮内、滴鼻或点眼。最后一次加强免疫多采用腹腔或静脉注射,目前尤其推崇后者,因为可使抗原对脾细胞作用更迅速而充分。 在最后一次加强免疫后第3天取脾融合为好,许多实验室的结果表明,初次免疫和再次免疫应答反应中,取脾细胞与骨髓瘤细胞融合,特异性杂交瘤的形成高峰分别为第4天和第22天,在初次免疫应答时获得的杂交瘤主要分泌IgM抗体,再次免疫应答时获得的杂交瘤主要分泌IgG抗 体。笔者体会阳性杂交瘤出现的高峰与小鼠血清抗体的滴度并无明显的平行关系,且多在血清抗体高峰之前。因此,为达到最高的杂交瘤形成率需要有尽可能多的浆 母细胞,这在最后一次加强免疫后第3天取脾进行融合较适宜。已有人报道采用脾内免疫,可提高小鼠对抗原的免疫反应性,且节省时间,一般免疫3天后即可融合。

折叠 细胞融合

首先制备细胞培养基、 氨基喋呤(A)贮存液、次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷(HT)贮存液等各种细胞生长所需的营养物质。然后制备髓瘤细胞和脾淋巴细胞,之后进行细胞融合。在细胞融合后选择性培养过程中,由于大量骨髓瘤细胞和脾细胞相继死亡,此时单个或少数分散的杂交瘤细胞多半不易存活,通常必须加入其他活细胞使之繁殖,这 种被加入的活细胞称为饲养细胞。饲养细胞促进其他细胞增殖的机制尚不明了,一般认为它们可能释放非种属特异性的生长刺激因子,为杂交瘤细胞提供必要的生长 条件;也可能是为了满足新生杂交瘤细胞对细胞密度的依赖性。

折叠 细胞筛选

杂交瘤细胞在融合后2周左右即可筛选,即把分泌所需抗体的杂交瘤孔从众多的孔中选出来,通常也称为抗体检测。抗体检测的方法很多,通常根据所研究的抗原和 实验室的条件而定。但作为杂交瘤筛选的抗体检测方法必须具有快速、准备、简便,便于一次处理大量样品等特点。因为往往有几百个样品需要在短短几个小时就报 告结果,以便决定杂交瘤细胞的取舍。所以选用抗体检测方法的原则是快速、敏感、特异、可靠、花费小和节省人力。一般说来,在融合之前就必须建立好抗体检测 方法,并克服可能存在的问题。另一个重要问题是抗体检测方法所需要的"动力学范围",即检出背景以上的最强与最弱信号之比,依所用的检测抗原是否纯净而 定。如杂交瘤抗体是针对纯化的蛋白质抗原的,100%的抗原参与反应,一个阳性/阴性判别系统就够了。另一方面,如果杂交瘤抗体是针对细胞表面微量的蛋白 抗原,检测系统可能需要能测出微弱信号,则动力学范围至少应为10:1,最好为100:1。另外,检测方法的选择还受所需杂交瘤抗体的类型和预定的用途的 影响。结合补体的抗体可以用基于细胞毒性反应的检测方法来选出。如需结合A蛋白的杂交瘤抗体,就要用结合蛋白A的检测方法。

折叠 克隆化

从原始孔中得到的阳性杂交瘤细胞,可能来源于二个或多个杂交瘤细胞,因此它们所分泌的抗体是不同质的。为了得到完全同质的单克隆抗体,必须对杂交瘤细胞进 行克隆化。另一方面,杂交瘤细胞培养的初期是不稳定的,有的细胞丢失部分染色体,可能丧失产生抗体的能力。为了除去这部分已不再分泌抗体的细胞,得到分泌 抗体稳定的单克隆杂交瘤细胞系(又称亚克隆),也需要克隆化。另外,长期液氮冻存的杂交瘤细胞,复苏后其分泌抗体的功能仍有可能丢失,因此也应作克隆化, 以检测抗体分泌情况。通常在得到针对预定抗原的杂交瘤以后需连续进行2-3次克隆化,有时还需进行多次。所谓克隆化是指使单个细胞无性繁殖而获得该细胞团 体的整个培养过程。克隆化的方法很多,如有限稀释法、软琼脂法、单细胞显微操作法、单克隆细胞集团显微操作法和荧光激活细胞分类仪(FACS)分离法。

折叠 冻存与复苏

(1)杂交瘤细胞的冻存。在建立杂交瘤细胞的过程中,有时一次融合产生很多"阳性"孔,来不及对所有的杂交瘤细胞作进一步的工作,需要把其中一部分细胞冻存起来;另一方面,为了防 止实验室可能发生的意外事故,如停电、污染、培养箱的温度或CO2控制器失灵等给正在建立中的杂交瘤带来灾难,通常尽可能早地冻存一部分细胞作为种子,以 免遭到不测。在杂交瘤细胞建立以后,更需要冻存一大批,以备今后随时取用。

(2)杂交瘤细胞的复苏。杂交瘤细胞、骨髓瘤细胞或其他细胞在液氮中保存,若无意外情况时,可保存数年至数十年。复苏时融解细胞速度要快,使之迅速通过最易受损的-5℃-0℃,以防细胞内形成冰晶引起细胞死亡。

折叠 鉴定单抗特性

⑴ 单克隆性的确定 包括杂交瘤细胞的染色体分析、单抗免疫球蛋白重链和轻链类型的鉴定和单抗纯度鉴定等。

⑵ 单抗理化特性的鉴定。从实用意义上说,单抗对温度和PH变化的敏感性以及单抗的亲合力都是理化特性鉴定的主要项目,它们可为单抗的使用和保存提供重要依据。

⑶ 单抗与相应抗原的反应性测定。单抗与相应抗原的反应性决定于它所识别的抗原表位,确定单抗针对的表位在抗原结构上的位置,是单抗特性鉴定的关键环节,同时,进一步分析这类表位的差别, 可正确评价单抗的特异性和交叉反应性。

折叠 编辑本段 特点

一是特异性,针对特定的单一抗原表位,它具有高度的特异性,抗肿瘤抗体药物的研究表明,其特异性主要表现为特异性结合、选择性杀伤靶细胞、体内靶向性分布以及具有更强的疗效。

二是多样性,主要表现在靶抗原的多样性、抗体结构的多样性、作用机制的多样性等方面。

三是定向性,抗体药物可以定向制造,就是根据需要制备具有不同治疗作用的抗体药物。基于这些特点,我们可以用来制成"生物导弹"运送药物至病害部位,主要是癌细胞,从而达到治疗效果。

折叠 编辑本段 类型

折叠 鼠源性抗体

杂交瘤单克隆抗体制备技术的基本原理是利用聚乙二醇作为细胞融合剂,使免疫的小鼠脾细胞与具有不断繁殖能力的小鼠骨髓瘤细胞在体外进行融合,在HAT选择性培养基的作用下,只让融合成功的杂交瘤细胞生长,经过反复的免疫学检测筛选和单个细胞培养(克隆化),最终获得既能产生所需单克隆抗体,又能不断繁殖的杂交瘤细胞系,将这种细胞扩大培养,接种于小鼠腹腔,在其产生的腹水中即可得到高效价的单克隆抗体。由于单抗的应用是从体外诊断向体内肿瘤定位和治疗方向发展,故鼠源性单抗出现了难以克服的缺点,特别是在体内应用时,存在主要组织相容性抗原(MHC)和超敏反应问题。随着鼠源单克隆抗体在临床治疗中越来越广泛的应用,降低抗体免疫原性的要求也变得越来越迫切。为了克服这一问题科学家利用基因工程方法使小鼠的抗体人源化。通过构建人一鼠嵌合抗体,在一定程度上减弱了人抗鼠抗体。

折叠 人鼠嵌合抗体

为了克服鼠源性单克隆抗体存在的问题,科学家利用基因工程方法使小鼠的抗体人源化。通过构建人一鼠嵌合抗体,在一定程度上减弱了人抗鼠抗体。1984年Morrison等人成功地构建了第一个人鼠单克隆抗体即嵌合抗体。嵌合抗体指的是鼠单克隆抗体的恒定区基因被人抗体的恒定区基因通过基因重组技术所替换而编码并在合适的宿主细胞中表达而产生的单克隆抗体。

基本原理:抗体分子的特异性识别、抗原结合由轻链和重链可变区决定的,而异源蛋白产生的人抗鼠抗体反应的主要是抗体恒定区。将小鼠单抗恒定区用人源化恒定区代替而拼接成嵌合抗体,使其重链和轻链的可变区来自小鼠,恒定区来自人类。简言之嵌合抗体既具有抗原结合特异性,又大大地降低了鼠单抗的异源性。嵌合抗体是基因工程抗体最早研究出来的一种抗体,在肿瘤治疗和诊断方法已被广泛的应用。虽然嵌合抗体在一定程度上减弱了人抗鼠抗体反应,但仍存在一少部分鼠源成分。这直接导致抗体被迅速清除,从而降低治疗效果。

折叠 人源化抗体

1.改形抗体

1986年,Jones等人成功构建了第一个改形抗体,又称CDR移植抗体和人源化抗体,指将鼠单抗可变区中互补决定区(CDR)序列取代人源抗体相应CDR序列,重组构成既具有鼠源性单抗特异性,又保持人抗体亲和力的CDR移植抗体。迄今为止,已有100多种鼠单抗通过CDR移植得到了人源化。基本原理:抗体重链和轻链的可变区主要由CDR和骨架区(FR)组成。其中可变区的6个CDR是负责识别和结合抗原的区域,它们直接与抗原接触,决定了抗体的特异性。骨架区是可变区以外的其它部分,主要起着支持CDR的作用,而且它们的氨基酸组成和排列相对不易改变,因此,可以将鼠单抗的CDR移植到人单抗的骨架区,就有可能使人单抗获得鼠单抗一样的抗原特异性,并可以最大限度地降低鼠单抗的异源性,这样就得到了改形抗体。与嵌合抗体相比,改形抗体进一步减少了抗体中鼠源部分的比例,降低了人抗鼠抗体,但仍有抗体可能导致抗独特型抗体的产生且存在一些局限性,例如构建方法相对复杂,操作起来费时费力;抗体的晶体结构以及电脑模拟抗体的微细结构上都有很大的问题;降低免疫原性和保持抗原结合活性方面还有很多问题。理所当然,寻找既能实现人源化又可以保持高的免疫学活性的简单易行方法势在必行。

2.表面氨基酸残基人源化一一镶面抗体

1991年由Padlan提出的与CDR移植完全不同的降低鼠源抗体免疫原性的方法。[9]其理论依据是分析了大量鼠单抗可变区和人单抗可变区氨基酸残基的表面暴露情况,结果发现这些暴露的氨基酸残基位置和数量都非常保守,不因为种属和型别而改变。研究表面,这些暴露的氨基酸残基是鼠源可变区免疫原性的主要来源。将鼠单抗可变区表面暴露的骨架区氨基酸残基中与人可变区相应的氨基酸残基改为人源的,就可以使可变区表面人源化,消除了异源性而不影响可变区的整体空问构象。

3.表位印记选择

表位印记选择指的是一种与高效筛选噬菌体抗体库技术相结合的人源化抗体的方法,可以通过数论筛选就能得到完全人源的抗体。基本原理:鼠单抗的一个重链或者轻链可变区基因与人源抗体的重链或者轻链的可变区基因文库配对,得到杂合的人鼠抗体库。借助噬菌体抗体库的高效筛选方法,能迅速得到所需抗体,比CDR移植简单且能得到真正的人抗体。缺点:筛选工作量特别大。

折叠 小分子抗体

小分子抗体顾名思义是分子量较小的抗体片段,它的抗体分子的抗原结合部位仅仅局限于重链和轻链的可变区。虽然分子很小但它既保持了亲本单抗的亲和力具有亲本单抗一样的特异性。种类主要包括:抗原结合片(Fab)抗体、Fv抗体、单链抗体、单域抗体与最小识别单位。

1.Fab抗体

Fab抗体为仅含Fab分子,Fab段由完整的轻链(恒定区CL和可变区VLCL)和重链Fd段(第一恒定区CH1和可变区VH)通过一个二硫键连接形成异二聚体,整个分了大小约占总抗体的三分之一,仅含有一个抗原结合位点。将完整轻链和重链Fd的编码基因进行连接,可在大肠杆菌中表达,形成完整的二硫键和立体折叠,可以保存Fab断的功能。常被用于实验室的研究工具。

2.Fv抗体

Fv抗体仅由轻链和重链的可变区组成通过非共价键连接,是抗体分了保留完整抗原结合部位的最小功能片段。该片段由于是通过非共价键连接的,所以稳定性不好,十分容易解离。采用适当的方法来解决Fv片段稳定性问题。

3.单链抗体

单链抗体的问世解决了Fv抗体的稳定性问题。它由适当的寡核普酸序列将轻链和重链可变区连接而成,形成单一链的分子,故称为单链抗体。就是单一链的结构大大增加了Fv片段的稳定性。相对完全抗体而言,单链抗体在临床上作为治疗剂有好多优越性。但它也有亲和力下降等缺点。

4.单域抗体

单域抗体仅含重链可变区,结构比Fv的亚单位还小,它是一个具有抗原结合活性的分子。同完整抗体相比,单域抗体仍然具有与抗体结合的同等能力及稳定性。

5.最小识别单位

比单域抗体还小的最小识别单位仅含可变区中单一CDR结构,分子量十分小仅占完全抗体的1%左右,亲和力也相当低,所以被命名为最小识别单位。虽然最小识别单位分子量小、亲和力低,但是它具有与抗原结合的能力。

折叠 人源性抗体

从最初的鼠源单抗技术到人源化技术,单克隆抗体在几十年的岁月中取得了突飞猛进的发展。人源化的问世使单克隆抗体基本解决了人抗鼠源性问题。但有用人源化的抗体基因均来自杂交瘤细胞。杂交瘤的这个操作过程很复杂且耗时加之利用杂交瘤技术难以制备自身抗原抗体和全人源抗体,这两大缺点成为基因工程抗体应用的绊脚石。随着科学技术的不断进步单克隆抗体进入了一个崭新的发展阶段一一人源性单克隆抗体。它主要包括噬菌体抗体库技术、转基因小鼠制备人源性抗体、核糖体展示技术三部分。

折叠 编辑本段 临床应用

折叠 疾病诊断

利用单抗进行疾病的诊断目前主要表现在人类疾病和畜禽传染病的诊断方面,尤其在一些感染性疾病和肿瘤的诊断方面。主要通过鉴定病原体或肿瘤抗原来诊断人是否感染相应疾病。

折叠 疾病治疗

目前利用单抗对疾病进行治疗已取得了很大的成果,主要是将单抗同药物耦联,再与病原体或肿瘤的特异抗原结合后发挥作用。

折叠 食品卫生

目前,单克隆抗体技术在食品生产加工以及科学研究中得到广泛的应用,食品基质中的细胞、大分子聚合物的小分子半抗原物质均能通过单克隆技术研究或检出。 如,用单克隆抗体技术快速检测食品中的农兽药。单克隆抗体在乳品工业中主要用于牛奶成分分析,尤其对非正常风味牛奶的微生物与酶的鉴定;牛奶中的病原微生物和毒素的检测;加工工艺对牛奶蛋白结构的影响以及牛奶中掺物的识别。

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