这一类的限制酶来源各异，识别的靶序列也不相同，但产生相同的粘性末端。由同尾酶(isocaudamer)产生的DNA片段，是能够通过其粘性末端之间的互补作用彼此连接起来的。 当把同尾酶切割的DNA片段与原来的限制性内切酶切割的DNA片段连接后，原来的酶切位点将不存在，不能被原来的限制性内切酶所识别。
例如:BamHI和Bgl II，Sal I和Xho I 就是我们常见的同尾酶。
BamH I的切割位点如下:
5'-G^GATCC-3'
3'-CCTAG^G-5'
Bgl II的切割位点如下:
5'-A^GATCT-3'
3'-TCTAG^A-5'
Sal I的切割位点如下:
5'-G^TCGAC-3'
3'-CAGCT^G-5'
Xho I的切割位点如下:
5'-C^TCGAG-3'
3'-GAGCT^C-5'
是基因工程重要的工具酶。