2021-09-11 18:33:18

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甲基化酶,原核生物甲基化酶是作为限制与修饰系统中的一员,用于保护宿主DNA不被相应的限制酶所切割。在E.coli中,大多数都有三个位点特异性的DNA甲基化酶

基本信息

  • 用途

    保护宿主DNA不被相应限制酶切割

折叠 编辑本段 种类

Dam 甲基化酶

Dam 甲基化酶可在 GATC 序列中的腺嘌呤 N6 位置上引入甲基。一些限制酶(PvuⅡ, BamHⅠ、BclⅠ、BglⅡ、XhoⅡ、MboⅠ、 Sau3AⅠ)的识别位点中含 GATC 序列,另一些酶 ClaⅠ(1/4)、 XbaⅠ(1/16)、TaqⅠ(1/16)、MboⅠ(1/16)、 HphⅠ(1/16) 的部分识别序列含此序列,如平均 4 个 ClaⅠ 位点(ATCGATN)中就有一个该序列。

有些限制酶对 Dam 甲基化的 DNA 敏感,不能切割相应的序列,如 BclⅠ、 ClaⅠ、 XbaⅠ 等。对甲基化不敏感的有 BamHⅠ、 Sau3AⅠ、 BglⅡ、 PvuⅠ 等。 MboⅠ 和 Sau3AⅠ 识别和切割位点相同,但其差异就在于前者对甲基化敏感。

一般哺乳动物 DNA 不会在腺嘌呤 N6 上甲基化,因此对甲基化敏感的限制酶切割这些 DNA 不会受到影响。当需要在这些敏感位点上完全切割 DNA 时,可利用 dam- E.coli 扩增并提取 DNA 。

Dcm 甲基化酶

Dcm 甲基化酶识别 CCAGG 或 CCTGG 序列,在第二个胞嘧啶 C 的 C5 位置上引入甲基。受 Dcm 甲基化作用影响的酶有 EcoRⅡ(↓CCWGG)。大多数情况下,其同裂酶 BstNⅠ(CC↓WGG)可避免这一影响,因为二者识别序列虽然相同,但切点不同。

受此甲基化酶影响的酶还有 Acc65Ⅰ、 AlwNⅠ、 ApaⅠ、EcoRⅡ 和 EaeⅠ 等。不受此甲基化影响酶有 BanⅡ、 Bg1Ⅰ、 BstNⅠ、 KpnⅠ 和 NarⅠ 等。

EcoKⅠ 甲基化酶

EcoKⅠ 甲基化酶的识别位点少,识别 AAC(N)6GTGC 和 GCAC(N)6GTT 序列中 A 的 N6 位置。但因为识别位点少(1/8kb),所以研究较少。

SssⅠ 甲基化酶

SssⅠ 甲基化酶来自原核生物 Spiroplasma ,可使 CG 序列中的 C 在 C5 位置上甲基化。甲基化的模板可以是甲基化或半甲基化链(新合成链)的 DNA 链。 SssⅠ 甲基化的 DNA 受 E.coli 中 mcrA、 mcrBC、 mrr 系统的限制。许多酶对此甲基化敏感,如 AatⅡ、 ClaⅠ、 XhoⅠ、 SalⅠ 等,也有不敏感的,如 BamHⅠ、 EcoRⅠ、 SphⅠ 和 KpnⅠ 。

折叠 编辑本段 限制系统

E.coli 中至少有 3 种依赖于甲基化的限制系统 mcrA、 mcrBC 和 mrr ,它们识别的序列各不相同,但只识别经过甲基化的序列,都限制由 CpG 甲基化酶(M SssⅠ)作用的 DNA (限制即消化降解)。 Mrr 限制 m6A ; McrA 限制 HpaⅡ 甲基化修饰的位点; McrBC 切割两套半位点(G/A)mC ,这两套位点之间间隔 2kb ,最适为 55~103bp ,需 GTP ;大多数常用的 E.coli 都含这三个限制系统中的一个或几个,三个都不限制 Dcm 修饰的位点,Mrr不限制 dam、 EcoKⅠ、 EcoRⅠ 修饰的位点。

折叠 编辑本段 影响

修饰酶切位点

HincⅡ 可识别四个位点(GTCGAC、 GTCAAC、 GTTGAC 和 GTTAAC),甲基化酶 M.TaqⅠ 可甲基化 TCGA 中的 A ,所以 M.TaqⅠ 处理 DNA 后, GTCGAC 将不受 HincⅡ 切割。

M.MspⅠ 修饰的产物为 m5CCGG ,在 BamHⅠ 识别位点(GGATCC)前面如果为 CC 或后面为 GG ,那么经 M.MspⅠ 处理的 DNA (GGAT m5CCGG)对 BamHⅠ 不敏感(即抵抗切割)。

构建 DNA 文库时,用 AluⅠ(AG↓CT) 和 HaeⅢ(GG↓CC) 部分消化基因组 DNA 后,将得到的片段用 M.EcoRⅠ 甲基化酶处理,然后加上合成的 EcoRⅠ 接头,再用 EcoRⅠ 来切割时只有接头上的位点可被切割,从而保护基因组片段。

产生新的酶切位点

通过甲基化修饰可产生新的酶切位点。 DpnⅠ 是依赖甲基化的限制酶, TCGATCGA 受 M.TaqⅠ 处理后形成甲基化(A)产物 TCG*ATCG*A ,其中 G*ATC 即为 DpnⅠ 位点。

对基因组作图的影响

在研究哺乳动物 m5CG 、植物 m5CG 和 m5CNG 、肠道细胞 Gm6ATC 的甲基化水平和分布时,利用限制酶对甲基化的敏感性差异,大有作为。

折叠 编辑本段 相关研究

目的调查国内6个省市25家医院临床分离鲍曼不动杆菌中介导高水平氨基糖苷类抗生素耐药的16SrRNA甲基化酶基因armA、rmtA、rmtB的分布情况。方法收集2004年12月-2005年12月国内6省市8家省级医院、浙江省11个地区17家市级医院临床分离的700株鲍曼不动杆菌。琼脂稀释法测定其对妥布霉素、阿米卡星、庆大霉素、异帕米星、奈替米星5种氨基糖苷类抗生素的最低抑菌浓度(MIC)值;PCR筛选三种甲基化酶基因armA、rmtA、rmtB,克隆测序明确基因型;脉冲场凝胶电泳(PFGE)分析菌株的同源性;质粒抽提、接合试验及Southern杂交确定armA基因定位。结果对阿米卡星庆大霉素异帕米星奈替米星的耐药率分别为67.7%、70.9%、75.7%、63.5%和71.5%。对5种氨基糖苷类抗生素全部耐药的菌株有377株,其中334株检出armA基因;未发现rmtA、rmtB阳性菌株。armA基因阳性菌株PFGE分型以A、B、C为主。碱裂解法反复抽提未得到质粒,多次接合试验未成功;Southern杂交显示,armA基因分别位于克隆A、B、c菌株染色体ApaⅠ酶切PFGE约220、300、220kb大小的PFGE片段上。结论16SrRNA甲基化酶基因armA在鲍曼不动杆菌中广泛存在,armA基因位于鲍曼不动杆菌的染色体上。

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